实验方法与普通奶粉应有所不同，普通奶粉的货架期一般是以高温条件下脂肪成分的氧化酸败程度为指标来确定的；而益生菌奶粉产品的货架期则要以益生菌在产品中的存活数量为标志；并且，不同的益生菌株对温度等周围环境的敏感性是不同的，其活菌数下降程度在理论上也会因菌株的不同而有所差别。确定货架期*准确的方法是模拟实际存放时的环境状态放置，定期检测，直至产品的*不稳定性标志成分发生变化，即可确定出该产品的真实货架期。但在企业的实际生产过程中，需要建立一种有效的货架期预测方法，以便用较短的时间确定新产品的货架期，这种方法即为货架期预测加速实验。
加速实验是在加速条件下进行的稳定性实验，其目的是在较短的时间内，检测产品中标志性指标的变化情况，预测货架期，为产品的运输、贮存条件等提供实验依据。食品在储存期间会因外界环境和食品自身成分的性质而发生一系列的物理、化学和微生物的变化，从而使产品变质。引起食品变质的因素有很多，根据影响的强弱不同，用影响*大的因素作为加速实验的考虑因素。影响因素实验是在极端的条件下测试该因素对产品质量的影响程度，一般包括高温、高湿、强光照射实验，考虑到活性益生菌类产品，水分活度会影响微生物生长和存活，所以本实验在影响因素中加入水分活度一项。本研究就是根据益生菌类产品的特点，用影响*强烈的因素为加速实验的条件，检测活菌数指标，建立预测产品货架期的加速实验方法。ATCC53103、LrGG-105；嗜酸乳杆菌：为两株商业菌SD5221、L.a-201.8.5 g NaCl溶解于1000 mL蒸馏水，121℃、15 min高压灭菌后pH7.0.MRS琼脂培养基：115℃、15 min高压灭菌。
JJT-900型洁净工作台，LRH- 250-Ⅱ型微电脑控制生化培养箱，HVE-50型全自动高压灭菌锅，AB104型电子天平，C10-P21型循环水浴锅，MZ-2070MGZ微波炉，将奶粉的待测样先放置于室温下12 h，以使其温度与室温相同。称取10 g样品于稀释液中，混合60 s，以确保悬浮液均匀一致。逐级稀释悬浮液，在15 min内将每个不同稀释倍数的样品液1 mL分别接种到温度为4447℃的MRS琼脂培养基平皿中，于（37±1）℃厌氧条件下培养72 h.选取菌落数在30300之间的培养皿进行计数。将混有益生菌ATCC53103的奶粉分别在45、37、30、23℃条件下放置10 d，于起始时间0、第5天、第10天取样检测活菌数。选择0.23、0.21、0.20、0.19、0.18、0.16、0.14 7种不同水分活度的奶粉基料分别与益生菌ATCC53103混合，于37℃条件下存放一个月，每隔3 d检测一次活菌数。在相同温度下，将混有益生菌ATCC53103的奶粉分别在光照箱及暗箱中放置10 d.于起始时间、第5天、第10天取样检测。温度为室温（23℃）。选择上述实验中确定的条件，在奶粉基料中分别添加ATCC53103、LrGG-105、SD5221、L.a- 201四株菌，混匀包装后，贮存4周，每周检测一次活菌数。益生菌的存活受温度影响很大，在不同温度条件下益生菌的存活结果益生菌ATCC53103在奶粉中的存活率随贮存时间延长而下降，贮存温度越高，下降越快。在45℃条件下，5 d时益生菌在奶粉中的活菌数下降5个数量级，10 d时未检出，下降速度过快，不适用。在37℃条件下，10 d时LGG在奶粉中的活菌数有一定下降，存活率为19.82%，下降速度适中。在30℃及23℃条件下，10 d后的存活率分别为91.40%和98.95%，较为稳定，与常温下存活差异不显著，不适用于加速实验。一些研究实验显示，有些益生菌在常温条件下贮存两年后仍有存活。因此，对于益生菌，选择37℃的温度条件适于加速实验。
水分活度是指食品在平衡状态下自由水的量，可被微生物所利用的部分，在物理化学上水分活度是指食品的水分蒸气压与相同温度下纯水的蒸气压的比值。奶粉基料的水分活度对益生菌在奶粉中的存活的影响结果，益生菌ATCC53103在不同水分活度奶粉中的存活稳定性随时间延长而降低，水分活度越高，菌的存活率下降速度越快。当基料水分活度低于0.16时，益生菌ATCC53103在奶粉中的存活较稳定。而当基料水分活度高于0.18时，37℃条件下存放一个月L.rhamnosus1活菌数下降两个数量级以上。奶粉基料水分活度与菌粉自身的水分活度0.15（本实验采用的冻干菌粉的水分活度为0.15）差值越大，越不利于益生菌在奶粉中的存活。
在益生菌应用研究的文献中指出，在婴幼儿配方奶粉中添加益生菌时，婴幼儿配方奶粉基料的理想水分活度应小于0.17，可使益生菌在贮存期间保持较长时间的存活稳定。在相同温度下，益生菌奶粉在光照及黑暗条件下贮存10 d，第5天与第10天时活菌数差异均不显著。所以，光照不是影响益生菌ATCC53103在奶粉中存活的主要因素。市场上奶粉的包装，主要有铝箔袋、金属听装、玻璃包装、塑料袋包装、礼品袋包装等，其中铝箔袋装在加速实验中可以不考虑光照的影响因素。按照温度实验结果，在37℃条件下存放分别添加了ATCC53103、LrGG-105、SD5221、L.a-201 4株菌的奶粉，选生产中较常出现的0.23为奶粉基料水分活度进行实验通过对不同厂家、不同批次的奶粉检测表明，奶粉水分活度通常在0.20～0.25之间。0.23*为常见，所以这里选0.23为奶粉基料水分活度进行实验。
在奶粉中的存活均呈下降趋势，其中SD5221*稳定，1个月后降至添加量的3.00%.ATCC53103稳定性*差，1个月后降至添加量的0.058%.L.a- 201、LrGG-105居中，存活率分别为0.079%和0.63%.4株菌在1个月内活菌数下降24个数量级。所以，37℃、1个月的条件可以作为益生菌奶粉加速实验的方法来对产品进行稳定性的监控管理。“对不同益生菌株在奶粉中存活的研究”中也采用了37℃作为加速实验中的温度条件。“益生菌在婴幼儿配方奶粉中的应用研究”中也使用过将样品置于37℃，保存一个月的研究条件。
当奶粉基料水分活度高于冻干菌粉水分活度越多，越不利于益生菌在奶粉中的存活的“益生菌在婴幼儿配方奶粉中的应用的研究”中指出，在婴幼儿配方奶粉中添加益生菌时，婴幼儿配方奶粉基料水分活度应小于0.17.所以又选取理想的0.17水分活度奶粉基料进行实验验证。在温度37℃、奶粉基料水分活度为0.17的情况下贮存4周，4株益生菌在奶粉中的存活均呈下降趋势，SD5221、LrGG- 105和ATCC53103的稳定均较好，1个月后分别降至添加量的8.54%、3.3%和2.3%.L.a-201较差，1个月后存活率为0.098%，下降四个数量级。所以，采用37℃作为加速实验温度条件对于在奶粉中常添加的ATCC53103、LrGG -105、SD5221、L.a-201 4株菌在0.23、0.17两种水分活度下均可行。
温度是影响益生菌ATCC53103奶粉稳定性的重要因素。37℃为益生菌ATCC53103奶粉加速实验的理想温度。奶粉基料水分活度也是影响益生菌ATCC53103奶粉稳定性的次重要因素。基料水分活度越接近冻干菌粉水分活度，益生菌在奶粉中的存活稳定性越强。光照不是影响益生菌ATCC53103奶粉稳定性的重要因素。温度37℃对于常用益生菌的奶粉产品均为理想温度条件，具有普遍适用性。加速实验条件确定为37℃下保存1个月。
本研究探讨了影响益生菌在奶粉中存活的因素，确定加速实验条件，并使用常用的著名益生菌来验证确立的加速实验条件，为进一步研究益生菌奶粉稳定性及货架期预测建立了理想的加速实验方案，并为货架期预测模型的建立提供了科学的实验数据和方法。