1.1供试材料
1.1.1片烟样品从青岛，青州，济南等地烟仓抽取正常和霉变样品，产地分别为河南，福建，山东，四川，云南，贵州，湖南，黑龙江，重庆等地（表1），其中正常片烟56份，等级为C3F，储存时间为12个月，霉变片烟13份。采集到的样品4保存备用。
1.2菌悬液的制备
准确称量片烟样品100g，装入有100mL无菌水的三角瓶中，200rpm摇床上震荡30min，用单层纱布过滤，将洗脱液配成梯度稀释的菌悬液，备用。
1.3微生物分离
微生物分离采用稀释分离法。用微量移液器从低浓度到高浓度依次吸取适当浓度的稀释液01mL，分别涂布于孟加拉红培养基上，26！培养3d后统计真菌数量；涂于牛肉膏蛋白胨培养基上，28！培养3d后统计细菌数量；涂于高氏1号培养基上，28！培养7d后统计放线菌数量。每个稀释度重复3次。
1.4微生物鉴定真菌的鉴定根据形态学特征，依据魏景超编着的真菌鉴定手册#鉴定到种。依据形态学特征和生理生化反应特征，参照有关文献进行将细菌和放线菌鉴定到属或类群。
1.5菌落计数与分类对培养后的样品进行带菌种类的检查。微生物计数按以下公式进行。
菌落密度（cfug-1）=平板每皿菌落数稀释倍数1000110检出率（%）=检出某种微生物样品数检测总样品数100相对分离频率（%）=某种微生物菌落数分离的微生物菌总落数100真菌区系分析根据各种真菌菌落在培养皿平均出现频率将其分为3类：平均相对分离频率<5%的为稀少真菌，平均相对分离频率5%~20%的为常见真菌，平均相对分离频率>20%的为优势种。
1.6致霉性测定
把分离到的微生物分别接种到经湿热灭菌的片烟上（50g），然后分别放入含10mL无菌水的灭菌培养皿中密封，置28！培养，以接种无菌培养基为对照，观察微生物对烟叶有无致霉性。
2.结果与分析
2.1片烟表面微生物
种类鉴定从各地采集的正常烟叶样品中，共分离鉴定出17属51个真菌菌株，其中，曲霉属8种，青霉属5种，酵母菌4种，根霉属2种，毛霉属6种，其它16种。未鉴定菌株尚余10株，这些菌绝大多数不产生孢子，没有产孢器，用普通观察法很难鉴定。从霉变样品中，共分离鉴定出13属29个真菌菌株，其中，曲霉属8种，青59张成省等山东仓储片烟表面微生物区系研究霉属5种，酵母菌2种，根霉属2种，毛霉属2种，其它6种，未鉴定4种。从正常烟叶和霉变烟叶上，共分离出11个细菌菌株，8个菌株归属于芽孢杆菌属（Bacillus），假单胞菌属（Pseudomonas），葡萄球菌属（Staphylococcus）各1株，未鉴定1株，芽孢杆菌分离种类约占烟叶表面细菌种类数量的80%.共鉴定出放线菌4个属10个菌株，主要为链霉菌属，小多孢菌属和小单孢菌属。
2.2片烟表面主要真菌的检出率
因产地不同，分离真菌种类虽有所差异，但整体上真菌类群比较接近，75%以上的真菌种类在各产地片烟上均有分布。从检出率来看，以曲霉，青霉，根霉，毛霉相对分离频率较高。检出率较高的种有黄柄曲霉（Aspergillusflavipes），黑曲霉（Aspergillusniger），黄曲霉（Aspergillusflavus），桔青霉（Penicilliumcitrinum），纯绿青霉（Penicilliumviridicatum），产黄青霉（Penicilliumchrysogenum）和毕赤酵母（Pichiastipitis），相对分离频率在50%~80%.聚多曲霉（Aspergillussydowii），烟曲霉（Aspergillusfumigatus），扩展青霉（Penicillium.expansum），总状毛霉（Mucorracemosus），葡枝根霉（Rhizopusstolonifer），黏红酵母（Rhodotorulaglutinis）检出率稍低，相对分离频率在20%~50%.交链孢霉（Alternariaalternata），米曲霉（Aspergillusoryzae），粗壮假丝酵母（Candidavalida）在各产地烟叶上均能检测到，但检出率在20%以下。
2.3正常与霉变片烟表面真菌区系比较
对所采集样品真菌区系分析发现，正常烟叶表面真菌种类有6~8种，其中，稀少真菌2~3种，常见真菌3~4种，优势种1~2种，优势种的菌落数占总菌落数的2857%~4183%。霉变烟叶真菌种类有3~4种，多数样品仅有稀少真菌和优势种，且优势种的菌落数占其总菌落数的70%以上，*高达9041%.61。
分析与讨论已有研究表明，烟叶在储存期间，表面存在大量的微生物群落。Reid率先发现，雪茄烟叶表面具有大量细菌和霉菌。Tallayo从烟叶上分离的微生物种类主要是芽孢杆菌和球菌。Morin等研究表明，加拿大烤烟调制期间的优势微生物类群为细菌，其次是真菌（包括酵母和霉菌）和耐热放线菌。陈福星研究表明在烤烟人工发酵中后期，烟叶表面均有大量稳定的微生物。不同学者分离鉴定的微生物种类和数量有别，这与烤烟品种，产地，时间，等级及发酵条件不同有关。综合前人研究结果，烤烟叶面微生物类群主要包括细菌，霉菌和放线菌，另有少量酵母菌。其中细菌占绝对优势，达到90%~99%，放线菌，霉菌和酵母菌比例甚小，与本研究结果一致（细菌比例达965%）。本研究结果还显示，正常片烟与霉变片烟表面微生物数量存在明显差异，霉变片烟表面微生物数量表现为真菌>细菌>放线菌。霉变片烟表面真菌，细菌，放线菌数量均显着大于正常烟叶，以真菌带菌量增加幅度*大（平均增幅达33025倍），细菌和放线菌带菌量变化幅度远小于真菌。可见，真菌菌落密度增加是烟叶霉变的显着特征之一。
片烟表面存在大量霉菌，但受地理，环境和研究手段的影响，各地优势种群不尽相同。冯克宽等研究发现，兰州地区水烟上主要霉菌黑根霉，黑曲霉，高大毛霉，互隔交链孢霉，产黄青霉，新月弯孢。赵文姬从云南烟叶上分离到的优势霉变菌株为黄曲霉原变种，烟曲霉椭孢变种和黑曲霉。晏卫红从广西烟仓储存烟叶中分离得到的优势霉变菌株为匍匐散囊菌原变种，溜曲霉，谢瓦散囊菌，菌核曲霉，米曲霉原变种，黑曲霉，孔曲霉和聚多曲霉。李魁等对河南，江西，福建等13个省市烟叶和成品香烟表面真菌调查研究发现，烟叶和成品香烟表面真菌以曲霉，青霉，根霉，毛霉检出率较高，优势种有黄柄曲霉，黑曲霉，黄曲霉，桔青霉，纯绿青霉，产黄青霉。可见，不同研究者，不同地区分离得到的烟叶表面霉菌以曲霉，青霉，根霉，毛霉为主，以曲霉和青霉检出率*高，但优势菌株不尽相同，可能与地理，环境，样品以及研究手段的差异有关。
本研究结果表明，山东仓储片烟主要霉菌类群为黄柄曲霉，黑曲霉，黄曲霉，桔青霉，纯绿青霉，产黄青霉，总状毛霉，匍枝根霉，以曲霉，青霉检出率较高，与前人研究结果基本一致。
本研究对山东仓储正常片烟和霉变片烟表面的微生物类群进行了鉴定，分析，明确了山东仓储片烟表面优势霉菌类群，为针对性地开展防霉工作提供了依据。
此外，本研究仅比较分析了正常和霉变片烟在微生物组成，带菌量等方面的差异，表明片烟霉变与真菌带菌量有一定的相关性。今后应进一步研究片烟霉变过程中表面真菌区系演替及与片烟品质的关系，以期利用片烟表面菌相，数量的测定来判定片烟储藏状态，利于霉变的快速检测。